基因组三维结构、类器官技术、微生物组学研究、大脑单细胞测序、癌症疫苗……突飞猛进的生物技术不仅推动了科学研究的发展，也渗入我们生活的方方面面，影响着当今人类的生活与健康。对此，《细胞》杂志发布特刊，专题讨论最新生物技术的前沿和发展。中国科学院古脊椎动物与古人类研究所（以下简称“中科院古脊椎所”）付巧妹研究员受邀针对古DNA技术的发展与未来撰写评述性论文（第一作者为中科院古脊椎所特别研究助理刘逸宸）。该论文 “Evolving ancient DNA techniques and the future of human history” 于2022年7月21日在《细胞》杂志上在线发表。 

　　重建已灭绝古人类——尼安德特人和丹尼索瓦人——的全基因组、绘制全球人群迁徙交流历史、挖掘最古老东亚现代人“田园人”的遗传结构、揭示东亚人群末次盛冰期前后适应性基因的变化、追溯中国南北方人群格局的形成、溯源南岛语系人群的中国南方起源……在过去十余年里，研究人员利用古DNA技术发掘出那些遗落了成千上万年的遗传信息，从中抽丝剥茧，不断刷新我们对人类历史的认知。 

　　受《细胞》杂志邀请，付巧妹及团队撰文回顾了古DNA技术的发展历史和突破，探讨了目前的技术瓶颈和解决方案，展望了未来古DNA技术的发展方向与前景。 

　　一网打尽——高通量测序革新古DNA领域 

　　高通量测序，又叫“二代测序”，是一种快速测定大量DNA序列的技术。在高通量测序普及之前，古DNA领域只能依赖PCR技术测定少数特定DNA片段的序列。这种方法获取的DNA信息极其有限，而且难以区分真正的古DNA和污染DNA。高通量测序理论上能测序样本中所有DNA分子的信息，且成本逐年降低。即使是含量极低的古DNA，也能很有效地对其进行测序。不仅如此，通过生物信息学手段（如mapDamage软件），我们还能快速检测样本中是否存在古DNA损伤，从而达到鉴别古DNA的目的。这一方法，也成了领域中古DNA检测的重要标准。 

　　除此之外，研究人员还根据古DNA的特点，对高通量测序的实验方法（DNA文库构建）进行了多种调整与优化。其中，half-UDG处理和单链DNA文库的构建是最重要的两项技术突破。Half-UDG技术既能保留部分DNA末端损伤，又能修复大部分古DNA损伤，从而在保留古DNA特征的同时，提高古DNA测序结果的准确性。单链DNA文库则是针对古DNA中常常存在大量单链粘性末端的情况，直接将双链DNA变性成单链DNA构建文库，从而更有效地测序受损的单链古DNA。 

　　挑战极限——DNA捕获技术的应用和发展 

　　尽管高通量测序已能较为有效地测序古DNA，但由于古DNA提取物中常常包含大量污染DNA，使得测序的大部分DNA分子都是无用的信息，真正有用的古DNA序列常常只占测序数据的1%不到。对此，研究人员在古DNA领域研发应用了DNA捕获技术——通过设计DNA或RNA探针，像钓鱼一样把目标古DNA从海量的污染DNA中“钓取”出来。这项技术广泛应用于人类古基因组研究中，目前超过2/3的人类古基因组数据来自于一个叫“1240k”的探针组的捕获数据。 

　　DNA捕获技术不仅使得对古DNA的测序效率大大提高，还能有效从一些“棘手”的样本中得到足够的数据用以分析。一个典型的例子是去年发表在《细胞》杂志上的古代南方人群的基因组研究。中国南方温暖潮湿的环境和当地的酸性土壤都不利于古DNA的保存，使得这片区域的古DNA研究一度处于空白状态。利用DNA捕获技术，付巧妹团队成功获取了30个古南方人群的基因组信息，揭示了一万余年以来东亚和东南亚交汇处的人群遗传史。 

　　最近，古DNA研究人员进一步挑战极限，他们脱离化石的桎梏，直接从“土”（沉积物）里提取古DNA。这项技术已成功应用在丹尼索瓦洞和白石崖溶洞中，成功获取了数万年前的古老型人类的DNA。 

　　未来可期——提升效率、拓展视野、着眼当今人类健康 

　　虽然古DNA领域成果丰硕，但古DNA研究却一直充满了艰辛和挑战。古DNA本身极易受到污染，其实验也极为精细，以往古DNA提取和建库几乎全程都依赖人工操作。最近，在全球少数几个实验室中，部分古DNA实验步骤成功整合到全自动移液机器人平台中，不仅极大节省了人力和物力，还减少了人工操作引入污染的风险。然而，目前样品的前处理步骤仍只能依赖人工，如何把这项耗时耗力的工作整合到自动化体系中，是古DNA实验技术的需要攻克的下一道难关。 

　　另外，古DNA技术的应用远不止于人类古基因组。通过古微生物信息追溯古代疫病流行和共生微生物演化、利用古表观遗传学信息探究古代动物和环境的相互作用、以及利用古蛋白质探索更大时间尺度的人类演化，都是古分子的重要分支方向。如何更有效地获取这些信息，并将信息进行多维度结合，将是未来研究的难点之一。 

　　古DNA是带着时间刻度的遗传信息，它从独一无二的视角书写了人类数万年来的演化与适应。这些岁月的痕迹不仅记录了人类的遗传历史，还在持续地影响着现今人群的生理和健康。我们一些重要功能基因单倍型就推测来自于已灭绝古人类，这些基因涉及到先天免疫、脂代谢、高海拔适应性、肤色、新冠重症易感性等。还有我们东亚人群特有的与头发和牙齿表型相关的基因型，也是在末次盛冰期之后频率升高，推测与环境适应性相关。然而，还有很多很多古DNA研究发现的特殊基因型的功能还未能确定。在未来，可以通过构建动物模型并结合基因编辑技术对这些发现进行验证。结合古DNA技术与现代前沿分子生物学技术，我们将能更清晰地理解演化史对我们当今人类健康的影响。 

　　本论文由中科院古脊椎所刘逸宸特别研究助理，E. Andrew Bennett副研究员，付巧妹研究员共同完成。通讯作者为付巧妹研究员。本研究由中国科学院、国家自然科学基金委、腾讯科学探索奖及美国霍华德·休斯医学研究所资助。(Information of the authors and fundings) 

　　 论文链接: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.009